近年来，囊胚移植已经逐渐取代卵裂期胚胎移植，成为大部分生殖中心胚胎移植的主流方案。与卵裂期（D3）胚胎相比，囊胚移植可显著提高IVF/ICSI-ET助孕患者的临床妊娠率和活产率[1-2]。但是如何进一步提高囊胚的种植率与妊娠率，依然是生殖医学学者密切关注的热点问题之一。根据发育天数不同，囊胚多分为第5天（D5）囊胚和第6天（D6）囊胚。
近年来，国内外大量学者对新鲜周期和冻融周期D5与D6囊胚移植妊娠结局进行了分析，但结果并不一致[3-6]。本研究回顾性分析了我中心2015年1月至2017年10月进行囊胚移植的新鲜周期和冻融周期，比较D5和D6囊胚在新鲜周期和冻融移植周期中的妊娠结局，以期探索最佳的囊胚移植策略。
资料与方法
一、研究对象与分组
回顾性分析2015年1月至2017年10月在我院生殖中心行囊胚移植的患者资料。根据移植方案不同分为新鲜囊胚移植周期组（新鲜周期，256例）和冻融囊胚移植周期组（冻融周期，564例）。根据囊胚的发育天数不同，各组又分别分为D5囊胚组和D6囊胚组，其中新鲜周期中D5囊胚组157例，D6囊胚组99例；冻融周期中D5囊胚组350例，D6囊胚组214例。
纳入标准：
（1）在我中心行IVF/ICSI-ET助孕并行新鲜周期或冻融周期囊胚移植的患者；
（2）女方年龄＜42岁；
（3）采用我中心标准长方案或拮抗剂方案进行促排卵。
排除标准：
（1）同一冻融周期中同时移植D5和D6囊胚的患者；
（2）有宫腔粘连等明确影响胚胎着床因素的患者。
二、治疗方案
1、控制性促排卵、受精和胚胎培养：根据患者情况采用本中心标准长方案或拮抗剂方案促排卵，定期B超监测卵泡发育情况并测定血清卵泡刺激素（FSH）、雌激素（E2）、黄体生成素（LH）、孕酮（P）水平，调整促性腺激素（Gn）用量。适时给予HCG5000~10000U进行扳机。36h后在阴道超声下取卵。根据男方精液参数行IVF或ICSI受精，IVF受精4h后通过观察极体排出情况决定是否需要行补救性ICSI。釆卵后第1天观察卵母细胞受精情况。釆卵后第3天将胚胎转移至囊胚培养液中继续培养，第5天和第6天观察囊胚形成情况并采用Gardner囊胚等级评分系统[7]进行囊胚分期和评分。即根据囊胚腔扩张程度分为1~6期，根据内细胞团（ICM）和滋养细胞层（TE）细胞数分为A、B、C三个等级。选取正常受精的可利用囊胚（3期以上ICM/TE不同时为C级）进行移植或冷冻。根据ICM/TE评分将可利用囊胚再分为优质囊胚（ICM/TE评分为AA，AB或BA）、次优囊胚（ICM/TE评分为BB）及低等级囊胚（ICM/TE评分有一项为C）。
2、囊胚冷冻复苏与胚胎移植：新鲜周期根据囊胚发育天数在釆卵后第5天或第6天进行移植。冻融周期中，所有的囊胚均采用玻璃化冷冻法进行冷冻复苏，具体操作方法见本中心已发表文献[8]。拟行冷冻囊胚移植的患者，根据患者月经周期情况采用人工周期或自然周期行内膜准备，分别于黄体酮转内膜或排卵后第5天进行胚胎复苏，培养2~4h后移植。
3、移植后处理与随访：移植后给予每日黄体酮注射液（浙江仙琚制药）40mg肌注及地屈孕酮片（达芙通，雅培，荷兰）20mg口服进行黄体支持。胚胎移植后14d查血HCG，若为阳性，则于移植后30~35d行B超检查观察孕囊和胎心搏动。移植后3个月电话随访是否有早孕流产或异位妊娠。
4、分析指标：比较各组间患者年龄、不孕年限、体重指数（BMI）、不孕原因、不孕类型；促排卵/内膜准备方案、胚胎移植日子宫内膜厚度、移植胚胎数目、胚胎质量；临床妊娠率、胚胎种植率、异位妊娠率和流产率等。
三、统计学方法
所有数据采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，使用独立t检验或方差分析。计数资料以百分率（%）表示，采用Pearson卡方检验或Fisher精确检验。P＜0.05表明差异具有统计学意义。
结 果
一、各组间患者一般情况比较
本研究共纳入820个周期的患者资料，其中新鲜周期D5囊胚组157例，新鲜周期D6囊胚组99例，冻融周期D5囊胚组350例，冻融周期D6囊胚组214例。四组间患者年龄、不孕年限、BMI、不孕类型、不孕原因均无显著性差异（P＞0.5）；新鲜周期D5囊胚组和D6囊胚组促排卵方案无显著性差异（P＞0.5）；冻融周期D5囊胚组和D6囊胚组内膜准备方案差异也无统计学意义（P＞0.5）（表1）。
二、各组间患者实验室资料比较
四组患者间获卵数、受精方式无显著性差异(P＞0.05）。尽管新鲜周期D6组中优质囊胚的比例低于其余3组，但差异无统计学意义(P＞0.05）。无论是新鲜周期还是冻融周期，D5组平均移植胚胎数和双囊胚移植率均显著高于D6囊胚（P＜0.05）（表2）。
三、新鲜周期与冻胚周期不同发育天数囊胚妊娠结局比较
新鲜周期中，D5囊胚的临床妊娠率和种植率均显著高于D6囊胚（P＜0.001），但冻融周期中D5与D6囊胚的临床妊娠率和种植率均无显著性差异（P＞0.05）。此外，由于新鲜和冻融周期中D5组平均移植胚胎数和双囊胚移植率较D6高，我们进一步比较了单囊胚移植和双囊胚移植在新鲜周期和冻融周期中的妊娠结局。结果发现，新鲜周期中D6组单囊胚和双囊胚移植的临床妊娠率和种植率均显著低于D5组（P＜0.05）。但是在冻融周期中，无论是单囊胚移植还是双囊胚移植，D5与D6组临床妊娠率和种植率均无显著差异（P＞0.05）。进一步比较新鲜周期与冻融周期的妊娠结局，发现两种周期D5组囊胚临床妊娠率和种植率均无显著差异（P＞0.05），但是冻融周期D6组的临床妊娠率和种植率显著高于新鲜周期（P＜0.05）。4组间早期妊娠丢失率和异位妊娠率均无显著差异（P＞0.05）（表3）。
讨 论
在IVF/ICSI-ET过程中，移植的胚胎根据体外培养时间的不同，可分为卵裂期胚胎和囊胚。囊胚经过了体外初步淘汰过程，移植后较卵裂期胚胎妊娠率显著提高[1-2]，且单囊胚移植在保证高妊娠率的前提下大大降低了多胎妊娠率[9]。近年来，囊胚移植在全世界范围内受到了广泛的推广和应用。但是如何进一步提高囊胚移植的妊娠结局，仍然是生殖学者关注的热点问题之一。
囊胚多在受精后第5天或第6天形成，因此根据发育天数不同，分为D5囊胚和D6囊胚。虽然已有不同学者对囊胚移植策略进行了分析，但是所得结果并不尽一致。Poulsen等[3]研究认为在新鲜周期中，D5囊胚比D6囊胚可以获得更好的妊娠结局，作者将这一结果归因于D6囊胚发育潜能受损。本研究结果与其一致，然而我们发现，当胚胎质量没有明显差异时，将D6囊胚行冻胚移植可以得到与D5囊胚相似的妊娠结局，这一结果与El-Toukhy等[5]研究结果一致，提示新鲜周期中D6囊胚妊娠率下降可能与内膜容受性有关。
众所周知，胚胎植入仅能发生在月经周期特定时期，即着床窗。子宫内膜容受性受雌、孕激素的调节[10]。在IVF助孕过程中，由于超生理剂量的Gn使用、多卵泡的发育使子宫内膜暴露于高雌激素环境，内膜容受性显著降低[11-12]。此外，在促排卵过程中，多采用大剂量HCG（5000~10000U）模拟LH峰诱导卵子成熟。HCG在体内的生物活性长达5d，可导致LH/HCG受体下调[13]。因此，子宫内膜在接受态后期可能不能对囊胚的植入产生应答。一项严格对照的研究比较了同一女性的非刺激周期黄体中期(LH+7)d和刺激周期黄体中期（HCG+7）d子宫内膜胚胎植入相关因子的表达变化。结果显示大多数与胚胎植入相关的基因（包括白血病抑制因子）在刺激周期中被下调[14]。另一项研究将传统的HCG诱发排卵与采用GnRH激动剂诱发排卵进行比较，结果发现HCG后7d两组子宫内膜基因表达谱存在显著差异[15]。这些数据表明，外源性和超生理剂量性激素可能会极大地影响子宫内膜发育的时机，从而加速关闭子宫内膜的植入窗口。
与新鲜周期相反，在冷冻胚胎移植周期中，子宫内膜的最佳接受期更宽，更接近生理状态[16-17]。在冻胚移植周期中，孕激素常用于子宫内膜的分泌转化使其具有接受性。最近的一项临床RCT显示在孕酮暴露第5天和第7天进行冷冻囊胚移植的妊娠结局无显著性差异[18]，提示在冻胚移植周期中，子宫内膜对囊胚植入的应答反应至少可持续3d。但是遗憾的是该项研究并未比较不同发育天数囊胚的妊娠结局。在本研究中，将D5或D6冷冻囊胚复苏后都移植到孕激素暴露第5天的子宫内膜，得到了相似的妊娠结局。提示冻融周期中，子宫内膜的囊胚植入种植窗更加灵活，但也可能与种植窗的调整有关。
本研究对新鲜周期和冻融周期不同发育天数囊胚的妊娠结局的进一步比较发现，D5囊胚在新鲜周期和冻融周期的妊娠结局并无显著差异，但冻融周期D6囊胚临床妊娠率和胚胎种植率显著高于新鲜周期。但是印惠荣等[4]对新鲜周期与复苏周期囊胚移植效果的比较研究认为冻融周期囊胚移植比新鲜周期可获得更好的妊娠结局，并且在复苏周期中第5天移植者比第6天移植者效果更佳。值得注意的是，该项研究中作者在进行新鲜周期和冻融周期妊娠结局比较时，并没有对第5天和第6天囊胚进行区分，我们有理由怀疑新鲜周期较冻融周期妊娠结局差可能是由于D6囊胚妊娠率低下所致。Zeng等[19]对新鲜周期和冻融周期单囊胚移植妊娠结局的Meta分析结果亦显示，冻融单囊胚移植并不能比新鲜囊胚移植获得更好的结局。陈培林等[20]对不同发育天数囊胚在冻融周期的妊娠结局进行分析，认为若移植胚胎为优胚，则囊胚形成时间对于妊娠结局无显著影响；但当移植囊胚为非优胚时，D5囊胚移植妊娠结局优于D6囊胚。由于影响妊娠结局的因素众多，如患者年龄、卵巢储备功能、疾病构成、宫腔环境、胚胎质量等，大部分研究者观察D5和D6囊胚的妊娠结局时未能同时对这些因素进行比较，因此也导致了不同的研究者得出不同的结论。在本研究中，我们尽可能多的比较了各组间影响妊娠结局的相关因素，以消除这些因素对结果产生的偏倚。但是由于本研究为基于临床数据的回顾性研究，尽管D5囊胚组的平均移植胚胎数和双胚胎移植率高于D6囊胚组，但是种植率的比较可以部分消除这一因素的影响。此外，本研究还发现，不论新鲜周期还是冻融周期，双囊胚移植的临床妊娠率均高于单囊胚移植，但胚胎种植率低于单囊胚移植，这一结果为单囊胚移植的推广应用提供了一定的依据，但其发生机制还有待进一步阐明。
综上所述，本研究比较了新鲜周期和冻融周期D5囊胚和D6囊胚移植后的妊娠结局。结果表明，D5囊胚在新鲜周期和冻融周期移植的妊娠结局没有显著差异。新鲜周期中，D6囊胚移植比D5囊胚移植的临床妊娠率和着床率更低，而冻融周期D6囊胚移植可达到与D5囊胚相似的结果，这可能与新鲜周期子宫内膜种植窗提前关闭及冻融周期种植窗的调整有关。因此，建议D6形成的囊胚应尽量避免新鲜周期移植，进行冷冻保存后择期行冻融胚胎移植可显著改善妊娠结局。
